Propuesta de investigación para el semestre:

August 23, 2008 at 10:49 pm (Uncategorized)

Para este semestre hemos propuesto trabajar con una genoteca de integrones clase 3.  Los mismos fueron econtrados en muestras del pueblo de Adjuntas.  Nuestros planes para este semestre, son desarrollar ésta y otras genotecas, y identificar cualitativamente las secuencias de los clones que se han extraído de integrones clase 1, 2 y 3.  En estas primeras semanas de clase, resucitamos clones de clase 2 y se prepararon para enviar a secuenciar.

 

Para este semestre espero haber logrado:

 

-La secuenciación de 56 clones de los integrones de clases 1 y 2.

-Análisis de las secuenciaciones

-Expandir los experimentos en busqueda de integrones clase 3 a través de la isla, en especial en el área de Adjuntas.

-Secuenciar los clones de Adjuntas, y analizar los datos obtenidos

-Multiplex PCR (planes futuros para mediados/fin de semestre)

 

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Fotos de mi laboratorio: Harvard Medical School/Brigham and Women’s Hospital

August 23, 2008 at 9:26 pm (Uncategorized)

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Experiencias de investigación en verano

August 23, 2008 at 7:54 pm (Uncategorized)

VERANO 2008

 

Este verano tuve la oportunidad de trabajar haciendo investigación en Harvard Medical School, como parte del programa SHURP.  Estuve en el Departamento de Rheumatología, Immunología y Alergias, con el Dr. Michael Brenner.  El laboratorio en el que trabajé contribuye con investigación en la patofisiología de artritis rheumatoide.  Me interesó muchísimo el tema, ya que mi madre ha padecido de la enfermedad por más de 25 años y una de mis mejores amigas fue diagnosticada, hace solo algunos meses.

En el laboratorio del Dr. Brenner, se encontró recientemente una proteina de adhesión de las células FLS (“fibroblast like synoviocytes”) la cual fue identificada como “cadherin-11” (cad-11).  Ellos pudieron probar que (cad-11) tiene un rol importante en la inflamación de pacientes con artritis rheumatoide (AR).  Experimentos previos a mi trabajo de verano fueron hechos, utilizando un modelo con ratones.  Como resultado de este modelo se demostró que en grupos de ratones en los cuales se inducía AR la presencia o ausencia  de esta molécula causaba cambios significativos en la inflamación y la erosión de cartílago.  Específicamente la ausencia de la proteína de adhesión disminuía la inflamación de un 30-50% y eliminaba casi por completo la erosión de cartílago.  Estos resultados fueron emocionantes, ya que en la tercera etapa de AR los pacientes experimentan un alto grado de inflamación y erosión de el cartílago y de los huesos.

Aunque los anti-cad11 actualmente se están movilizándo a “clinical trials”, el laboratorio deseaba poder simular la erosión de cartilago in-vitro, para poder hacer experimentos con la eliminación de la actividad de cad-11 (ya que el modelo in-vivo fue exitoso).  Aquí entró el tema para mi proyecto por el verano, que fue desarrollar un protocolo in-vitro para examinar el rol de cad-11 en la erosión de cartílago.

Para el desarrollo utilizamos cartilago de vaca, lo cortamos uniformemente en discos de 5mm de diámetro y los incubamos en presencia de células FLS (las cuales degradan el cartílago).  La erosión del cartílago fue medida por la presencia de glicosaminoglicanos en el medio en el que se suspendían las células y con el que se cubría el cartílago.  Como los glicosaminoglicanos son un componente importante del cartílago, y su presencia en el medio, es indicativo de que hubo erosión.  En los experimentos que hicimos, estudiamos el medio despues de la incubación obtuvimos resultados en los que se demostró la erosión, pero lamentablemente encontramos que de igual forma había erosión en los controles negativos (en los cuales solo se incubó el cartilago solo, sin las células degradadoras).  Por este motivo se sugirió como estudio futuro, utilizar otra forma para medir la erosión del cartílago.  Como alternativa una ELISA para colágeno tipo II que mide uno los productos de la degradación de colágeno, podría demostrar una forma alterna de medir cuantitativamente la erosión del cartílago (ya que el colágeno es un componente importante de la estructura del cartílago. 

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Temas que resumen mi experiencia en este primer semestre de investigación:

April 21, 2008 at 11:10 pm (Uncategorized)

 ¿Qué he aprendido?

Aunque había tenido la oportunidad de trabajar en este laboratorio el año pasado este año he aprendido muchísimas cosas nuevas.  He estado trabajando mucho en análisis de data, que creo que es uno de los pasos más difíciles.  Organizando secuenciaciones hechas y buscando en distintas bases de datos la relación de las integrasas que encontramos fue un proceso sumamente complicado.  Sin embargo, gracias a lo que el profesor Rodriguez me enseñó, hoy día puedo crear un árbol representativo de las identidades de integrasas nuevas con las ya descritas. 

¿Qué barreras y retos he tenido que afrontar para comenzar a realizar tu investigación?   ¿Cómo he logrado superar esas barreras y retos?

Creo que el reto mayor no está dentro del laboratorio solamente.  Para todo estudiante universitario, es sumamente difícil el poder hacer un balance entre las clases (que en el Colegio no están fáciles), y el laboratorio.  La organización y distribución del tiempo entre el laboratorio y las clases ha sido lo más retante.  Pero, aún así se puede hacer todo!  En mi caso, apuntarlo TODO resulta útil, porque entre exámenes y clases la mente se distrae mucho, y cuando uno regresa al laboratorio es bueno refrescar, exactamente lo último que se hizo y de esa forma continuar sin perder tiempo.

¿Cuáles son mis expectativas para el semestre próximo?

Para el próximo semestre, espero poder haber muestreado y haber hecho el screening de los integrones en las tres áreas de la planta de tratamiento de agua.  También deseo poder ampliar los experimentos que comenzé a hacer en las playas de PR que son directamente afectadas por descargas y desechos (rastreando integrones). 

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Técnicas de laboratorio/ visita a blogs de mis compañeros

March 18, 2008 at 9:44 pm (Técnicas de laboratorio)

En esta experiencia de investigación he tenido la oportunidad de aprender muchas técnicas que me han ayudado no solo a desarrollar mi proyecto, sino a ampliar el conocimiento que en el futuro me llevará a ser una científica exitosa.  He aprendido a hacer:  extracciones de DNA (regulares y específicas para el suelo), extracciones de plásmidos, transformaciones, clones (librerías), RE, programaciones con el thermocycler, medios, purificaciones, PCR etc.  Estas técnicas me han permitido hacer un ‘’screening”, de los integrones presentes en aguas tratadas, y comparar éstos con los ya encontrados en el escenario clínico.  Estas técnicas me permiten hallar con mayor facilidad la presencia de la resistencia a antibióticos en bacterias que prevalecen en este tipo de ambientes. 

Visitando los tres blogs que me fueron asignados (de tres respectivos compañeros), pude darme cuenta que al igual que yo, todos estamos trabajando fuertemente en nuestros proyectos de investigación.  También pude ver que ellos han tenido algunas dificultades en sus procedimientos pero han continuado muy animados.  El haber leido sus experiencias me ha servido a mi de más motivación, para seguir adelante a pesar de que tenga algunos obstáculos en el camino.

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Fotos INRO 2008

February 23, 2008 at 6:44 pm (Fotos INRO 2008)


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Fotos Variadas

February 23, 2008 at 5:51 pm (fotos variadas, slideshow)


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Experiencia de trabajo en equipo

February 23, 2008 at 5:02 pm (Experiencia de trabajo en equipo)

Experiencia de trabajo en equipo:

Durante este mes he tenido la oportunidad de trabajar mano a mano, con el Dr. Carlos Rodriguez y con la nueva estudiante subgraduada Glendalis Vargas.  Hemos trabajado en extracciones de plásmidos de unos clones aislados el semestre pasado.  Los mismos ya están listos para enviar a secuenciar.  Actualemente mi compañera está trabajando con unos clones de la planta de tratamiento de Mayaguez (los cuales contienen integrones), para también enviar a secuenciar y poder monitorear que tipo de microorganismos encontramos en las distintas partes de la planta de tratamiento de este municipio.  Comenzaré en la próxima semana extracciones de DNA del suelo de Isla de Mona y haré pruebas de unos controles que nos llegaron de Australia (junto con éstas extracciones).  Nos dirigimos hacia una preparación de multiplex PCR donde deseamos poder encontrar integrasas tanto de la clase 1 como de la 2 y 3.

En este tiempo me he dado cuenta de que existen ciertos procedimientos en los cuales se requiere colaboración en equipo.  En estos experimentos me ha sido de suma importancia el poder tener una buena comunicación con mi compañera de trabajo.  No siempre podemos ir al laboratorio a la misma vez y por consiguiente es de suma importancia que una sepa lo que la otra ha hecho, y de esta forma podemos continuar con el trabajo a realizarse. 

Dejar nuestras libretas de la investigación en el laboratorio ha sido útil para utilizar protocolos en común, para ver si ha habido alguna observación en los experimentos, o simplemente para verificar fotos de geles etc.  El reunirnos con el profesor, cuando tenemos algun percance, o cuando vamos a comenzar un nuevo experimento ha sido también importante, porque el nos aconseja y nos permite exponer algunas ideas que podemos complementar con la experiencia de laboratorio. 

Además de uno dejarse aconsejar, y de intentar tener buena comunicación, otras dos características que entiendo son cruciales en un investigador son la responsabilidad y la perseverancia.  El ser responsable te permite ser exitoso, conseguir los resultados y llevarte bien con los demás.  El ser perseverante también es importante, porque como científicos tendremos muchos experimentos en los que los resultados obtenidos no sean los esperados;  sin embargo si nos frustramos y no continuamos con una actitud positiva, no lograremos alcanzar nuestros objetivos.  Si en algun momento algo no nos sale debemos intentar de repetir los experimentos, verificar y optimizar protocolos, hacer investigación teórica sobre experimentos ya hechos (estudiar) o pedir ayuda a alguien que tenga experiencia en el área. 

Algunas cosas que pueden ser obstáculos en nuestro camino son:  el creernos que todo lo sabemos, el no escribir los resultados o procedimientos, la falta de comunicación o interés, el estrés etc.  Debemos tratar de perfeccionar el trabajo evitando caer en obstáculos que no solo nos atrasen, sino que también nos impidan alcanzar las metas que nos hemos trazado con nuestro mentor.

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Background Information of Bacterial Integrons

February 23, 2008 at 4:01 pm (Información sobre integrones bactarianos/Background in, My projecto/My proyect)

During the past 20 years a significant amount of information related to the mechanism and spread of antibiotic resistance has become available.   Recently, the impact of horizontally transmitted genetic determinants

and the role of recombination in the recruitment of resistance genes have been highlighted.  Resistance genes can be exchanged among bacterial populations. Several mechanisms for the acquisition and dissemination of resistance determinants involve DNA exchange and in this way resistance genes can spread efficiently among bacterial populations from animals and humans .  The identification of specialised genetic structures responsible for the acquisition of resistance genes on horizontal gene vehicles represents an important discovery in our understanding of antibiotic resistance mechanisms. Naturally occurring gene expression elements, called integrons, have been described as a very efficient genetic mechanism by which bacteria can acquire resistance genes. Integrons promote the capture of one or more gene cassettes within the same attachment site, thereby forming composite clusters of antibiotic resistance genes.

Integrons are gene expression systems that incorporate ORFs (open reading frames) and convert them into functional genes. The essential components of an integron include the integrase gene (intI), the attachment site (attI) and the promoter, which promotes the expression of any suitably integrated gene(s).

The most common integrons are classified by classes 1-3:

Class 1 represents the most common structure and most of the elements belonging to this class are characterized by the presence of two conserved segments, the 5’-conserved segment (5’-CS) and 3’-conserved segment (3’-CS). The 5’-CS contains the intI gene, the attI site and the promoter, while the 3’-CS codes for the sul1 gene, conferring resistance to sulphonamides and the qacED1 gene, conferring resistance to quaternary ammonium compounds used

as disinfectants. In addition, the 3’-CS carries the ORF5 encoding a protein of unknown function.

Class 2 integrons have also been described and these are included in the Tn7 family of transposons. Tn7 contains three integrated gene cassettes (dhfrIsat- aadA1) adjacent to a defective integrase gene (intI2) located at 5’-CS. The Tn7 attI site is located between the intI2 gene and the first inserted resistance gene as described for class 1 integrons. Class 2 integrons do not contain the sul1 gene but in fact include genes whose function promotes Tn7 transposition. 

To date, only one class 3 integron has been reported, containing the blaIMP gene cassette that confers resistance to broadspectrum b-lactams including carbapenems, and part of the aacA4 gene, previously identified

as a gene cassette in class 1 integrons. The integrase gene (intI3) demonstrated an identity of 60.9% to the intI1 gene at the amino acid level, with the gene cassette boundaries showing atypical recombination sites.  It is noteworthy that despite the differences in the integrase and attI site sequences, the same gene cassettes are thought to be acquired by all three integron classes, as identical gene cassettes have been found in classes 1 and 2 and in classes 1 and 3. This observation suggests that the class-specific integrases work on an apparently common pool of resistance gene cassettes.

Summary of the review:

Carattoli A.  Importance of integrons in the diffusion of resistance. Vet Res. 2001 May-Aug;32(3-4):243-59. Review.

PMID: 11432416 [PubMed - indexed for MEDLINE]

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Información de trasfondo sobre Integrones Bacterianos

February 23, 2008 at 3:32 pm (Información sobre integrones bactarianos/Background in)

Información de Trasfondo:

Las bacterias pueden transferir de unas a otras información genética, protegiéndose de múltiples antibióticos.  Esta resistencia se debe a la presencia de genes localizados en plásmidos y transposones.  Recientemente se ha descrito otro mecanismo que confiere resistencia: los integrones (Stokes HW. et al., 1989).  Los integrones, son elementos genéticos dinámicos en el que por un mecanismo de recombinación en un lugar específico, se acumula una combinación de genes estructurales organizados (Ploy et al., 2000). Los genes que se incorporan a los integrones se han denominado genes casete.  Tres elementos principales permiten la captura y expresión de los genes casetes en los integrones: uno que codifica una integrasa, (intI); el otro es el lugar de recombinación sitio-específico, (attI); y un promotor.  La clasificación de estos elementos se ha hecho en base a la secuencia de su integrasa. Las clases 1, 2 y 3 son las más estudiadas y están relacionadas a la resistencia de antibióticos.  Los integrones se encuentran ampliamente entre las especies de la familia Enterobacteriaceae (clase 2: Shigella sonnei y clase 3: Klebsiella pneumoniae) y en otras bacterias gramnegativas como Pseudomonas aeruginosa (clase 1) (Moraga R.M. et al., 2007).  

 Justificación y Relevancia:

La transmisión de genes que confieren resistencia a antibióticos entre enterobacterias y bacterias causantes de enfermedades nosocomiales, como Pseudomonas, ha ido en aumento (González et al., 2004). En cepas de Shigella se ha descrito un aumento progresivo de la resistencia a varios antibióticos, incluyendo a aquellos que son considerados de elección en el tratamiento de las infecciones que ellas producen. Destaca, por su importancia clínica y epidemiológica, la resistencia a ampicilina y sulfametoxazol-trimetoprim6 (Muñoz J, et al., 2003).  En  estudios realizados de genes casetes en integrones clase 3, se ha determinado que la especie Klebsiella pneumoniae es la bacteria que con más frecuencia aparece; resistente a aminoglucósidos y a cefalosporina de 3ra generación (Psichogiou M et al., 2007).  Cabe mencionar el reciente estudio en el que se aislaron 74 cepas de K. pneumoniae; se detectaron 13 genes casetes diferentes, en 11 tipos de combinaciones distintas (Yao F, et.al, 2007).  En Pseudomonas aeruginosa ha aumentado la resistencia a imipenem, ciprofloxacina, amicacina y ceftazidima (Cornejo-Juárez P et al., 2007).  La importancia de monitorear la entrada y salida de la planta de tratamiento de agua, es identificar la presencia de DNA y determinar si al final del proceso se encuentran presente los mismos genes casetes provenientes del ambiente hospitalario.  Esto resultaría en un posible aumento en el número de bacterias resistentes, debido a que los genes casetes libres en el ambiente, podrían insertarse en los integrones de bacterias no-resistentes.

Referencias:Cornejo-Juárez P, Velásquez-Acosta C, Sandoval S, Gordillo P, Volkow-  Fernández P.  (2007).  Antimicrobial resistance patterns of isolates  from urine cultures at an oncological center.  Salud Publica Mex. 49(5):330-6.    Flanagan JL, Brodie EL, Weng L, Lynch SV, Garcia O, Brown R,  Hugenholtz P, DeSantis TZ, Andersen GL, Wiener-Kronish JP, Bristow J.  (2007).  Loss of bacterial diversity during antibiotic treatment of intubated patients colonized with Pseudomonas aeruginosa.  J Clin Microbiol. 45(6):1954-62.      Flores X, Comas J, Roda IR, Jiménez L, Gernaey KV.  (2007).   Application  of multivariable statistical techniques in plant-wide WWTP control  strategies analysis.  Water Sci Technol. 56(6):75-  83.González G, Mella S, Zemelman R, Bello H, Domínguez M.  (2004).  Integrons and resistance gene cassettes: structure and role against antimicrobials.  Rev Med Chil.  132(5):619-26.Moura A, Henriques I, Ribeiro R, Correia A.  (2007).  Prevalence and characterization of integrons from bacteria isolated from a slaughterhouse wastewater treatment plant.  Antimicrob        Chemother.  2.Muñoz J, Bello H, Domínguez M, Mella S, Zemelman R, González G.  (2003).  Integrons and antimicrobial resistance gene cassettes in Shigella.  Rev Med Chil.  131(7):727-33.  Ploy MC, Lambert T, Couty JP, Denis F.  (2000).  Integrons: an antibiotic resistance gene capture and expression system.  Clin Chem Lab Med.  38(6):483-7.  Psichogiou M, Tassios PT, Avlamis A, Stefanou I, Kosmidis C, Platsouka E, Paniara O, Xanthaki A, Toutouza M, Daikos GL, Tzouvelekis LS.  (2007).  Ongoing epidemic of blaVIM-1-positive Klebsiella pneumoniae in Athens, Greece: a prospective survey.  J Antimicrob Chemother.  13Rubén Moraga M., Edgardo Santander P., Teresa Arias C. y Fermín Méndez A.  (2007).  Integrons and their relationship with resistance phenotype in Gram negative bacilli isolated in the Hospital Torres Galdames, Iquique, Chile.  24 (5): 384-390.Stokes HW, Hall RM.  (1989).  A novel family of potentially mobile DNA  elements encoding site-specific gene-integration functions:  integrons.  Mol Microbiol.  3(12):1669-83.

Stokes HW, Holmes AJ, Nield BS, Holley MP, Nevalainen KM, Mabbutt   BC, Gillings MR.  (2001).   Gene cassette PCR: sequence-independent recovery of entire genes from environmental DNA.  Appl Environ Microbiol. 67(11):5240-6.

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