#1

Nombre del estudiante investigador:   Rocío Rivera Valentín

Título del Proyecto: 

Generation and Screening of Metagenomic libraires from a tropical forest in Puerto Rico: searching for novel enzymatic capabilities.

 El trabajo de ésta estudiante enfocaba dos objetivos principales.  En primer lugar la utilización de bibliotecas metagenómicas de pequeño tamaño (hechas con muestras de suelo del Pico del Yunque de PR.  En segundo lugar el estudio detallado de dichas bibliotecas para la verificación de capacidades enzimáticas. 

En cuanto a la primera parte, Rocío logró extraer DNA de sus muestras de suelo, y las trató con endonucleasas para que los fragmentos fueran excisados, purificados, clonados a un vector y transformados a E. coli. De esto obtuvo varios clones, los cuales aisló para procederle a efectuar distintos experimentos.  En la segunda parte se estudiaron bibliotecas metagenómicas previamente creadas por su laboratorio, y les hizo un “screening” de actividad de proteasas, que resultó en posibles clones que próximamente se identificarán.

Entre sus planes futuros está la busqueda de actividad de DNAsas y el análisis de secuencias para la detección de otras secuencias enzimáticas. 

Estudiante de Carlos Ríos Ph.D at UPRM

#2

Nombre del estudiante investigador:   Jose G Montoyo

Título del Proyecto:  

Applying T7 phage display as a chemical combinatorial approach to search for specific biomarkers.

 El trabajo de éste estudiante trataba sobre la técnica “phage display”, la cual es un método para el estudio de interacciones que utilizan bacteriófagos para conectar proteínas con la información genética que las codifica.  Incluye interacciones tanto proteína-proteína, proteína-péptido y proteína-DNA.

El propósito de Montoyo, era emplear el método en éste proyecto para encontrar un biomarcador específico, y su especificidad por el ligando utilizando un alcanze químico combinatorial.  Para hallar el biomarcador, el estudiante llevó a cabo una serie de “biopannings” o lavados que consisten en separar los fagos enlazados de los no-enlazados.  Como punto interesante, en su investigación no es una molécula o una proteína lo que sirve como ligando, en cambio es toda una célula.  Dirigió sus intenciones a encontrar un biomarcador específico para Staphylococcus aureus y a examinar la especificidad de dos péptidos encontrados en investigaciones previas de Cryptococcus gattii.

Como resultados, luego de dos rondas de “biopanning” varios fagos fueron obtenidos para el aislamiento de biomarcadores específicos.  Montonyo también demostró resultados pasados C. gattii.

En experimentos futuros el estudiante espera el análisis in silico de los fagos aislados contra S. aureus, para determinar la identidad molecular de un posible biomarcador.

#3

Nombre del estudiante investigador:   Aslin M. Rodriguez-Nassif

Título del Proyecto: 

Methodology to assess the inhibition of α-Amylase by Tapeinochilus ananassae extracts.

 El trabajo de ésta estudiante trataba sobre la utilización de una planta para pacientes diabéticos y sus posibles efectos.  Su estudio fue basado en el análisis de que la obesidad es una variable importante en la diabetes y que para el manejo de la misma se ha sugerido como estrategia la inhibición de α-amilasa para reducir los niveles de azúcar en la sangre.  Utilizó la planta Tepeinochilus ananassae, en la cual examinó la inhibición de la enzima por extractos acuosos y metanólicos.  También hizo extractos con el flavonoide Quercetin y acarbosa (controles).  Con los extractos se calculó el porciento de inhibición de α-amilasa y se encontró que los extractos acuosos y metanólicos tuvieron una relación inversa en cuanto a la respuesta de inhibición enzimática (medida por concentración). 

Conclusiones de la estudiante:  la inhibición de α-amilasa no es un acercamiento terapéutico útil para el control de la diabetes. 

Partiendo del mes pasado (donde comenzé un nuevo proyecto) he logrado un progreso intermedio de al menos 50% del trabajo propuesto.  Me encuentro trabajando por el momento con los yogurts comerciales.  He podido extraer DNA de ellos de forma eficiente y amplifiqué el gen 16s rDNA. 

                         Info:   GEN 16s rDNA

                                                 Este gen contiene unas regiones altamente conservadas (efectivas para adición de primers),    pero de igual forma contiene regiones hipervariables que pueden proveer las identidades específicas de bacterias, lo que es útil para su identificación.  Como resultado este gen es altamente útil en la microbiología médica como una alternativa efectiva para métodos fenotípicos de identificación bacteriana.

La amplificación del 16s rDNA nos confirmó que el DNA contenido en los yogurts era amplificable y más que frutal de contenido bacteriano.  A partir de aquí nos movimos a amplificar para detectar la presencia de integrón clase 1 (intl 1).  De las cuatro muestras de yogurts comerciales (Food Club, Activia, Yo-Plait y Pascual), detectamos la presencia de integrón clase 1 en todas.  Con estos resultados ya confirmados, procedimos a concentrar el producto de PCR y hacer extracción del DNA concentrado.  Esto se llevó a cabo utilizando el protocolo de extracción por gel.  En este momento tenemos el DNA listo para proceder con la reacción de ligación y el proceso de clonación para la creación de la genoteca.

DIFICULTADES …y resoluciones.

La mayor dificultad durante este proceso ha sido que hemos tenido algunas alicuotas de reactivos de PCR contaminadas, lo que ha resultado en la amplificación constante del control negativo en nuestras muestras.  Para esto cojimos los tubos de “stock” e hicimos alicuotas nuevas para los reactivos principales (buffer, MgCl2, dNTP’s, BSA, Taq y H2O).

ABSTRACT:

Probing for clinical integrons in yogurt bacteria.

Integrons are a diverse and ancient bacterial genetic platform which facilitates the capture and expression of genes encoding a variety of adaptive functions, including resistance against antibiotics of medical and veterinary importance. Although these genetic elements are known to be horizontally transferred and commonly found among intestinal bacteria of clinical significance, little is known about alternative dispersal routes outside the clinical scene.  Since the prevalence of clinical integrons (classes 1, 2 and 3) in harmless or beneficial bacteria is an understudied subject and bacteria associated with processed milk products have been recently reported to survive transit in the human intestinal tract, we hypothesize that inconspicuous  carriers of clinical integrons may enter the intestinal niche through the food chain. To test this hypothesis we have applied molecular, culture independent methods for the detection of clinical integrons among bacterial populations present in commercial yogurt. We have extracted DNA from eight samples of four different brands and detected the presence of bacterial DNA and class 1 integron in all four of them, using primers specific for the 16SrRNA and intl1 loci.  We are also screening for the presence of antibiotic resistance mechanisms encoded by class 1 integrons and testing for the occurrence of class 2 and class 3 elements. By expanding the extant view of reservoirs of clinical integrons we expect to better understand and attenuate risks related to the emergence of antibiotic resistance due to the misuse of these drugs.

Propuesta de investigación para el semestre:

         Siendo éste mi último semestre de investigación subgraduada, he sido asignada con un proyecto a corto plazo, dirigido o encaminado mayormente al área de microbiología de alimentos (y algo de ecología microbiana).  Hemos propuesto (mi mentor y yo), hacer algunas pruebas con alimentos selectivos, en las que verifiquemos la presencia de integrones bacterianos resistentes a antibióticos.  Para dar comienzo a ésto, hemos escogido “Yogurts” comerciales con alta cantidad de probióticos (carga microbiana para regenerar la flora intestinal) y queso de hoja hecho en Puerto Rico.  Nuestro objetivo es identificar si la resistencia a antibióticos mediada por integrones, ha ido en aumento por auto-ingestión vía oral.

o   Metas a alcanzar al final de este semestre:

                    Espero haber logrado …
§  (1)…Extraer DNA bacteriano de los comestibles comerciales seleccionados
§  (2)…Una amplificación positiva del DNA bacteriano a partir del 16S
§  (3)…Ejecución de PCR’s para detectar la presencia de integrones clínicos clase 1, 2 y 3 (una vez se haya detectado la presencia de los genes de integrasas universales por la misma técnica)
§  (4)…A partir de los resltados que se obtengan en el transcurso del semestre, estudiar algún otro alimento, o inferir conclusiones objetivas a partir de nuestras predicciones.

·         ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

                    El semestre pasado trabajé mayormente con muestras ambientales, a las que les hacía pruebas moleculares para detectar la presencia de integrones bacterianos clínicos.  Aunque comenzamos a trabajar con yogurts, y la búsqueda de los integrones en los mismos, tuvimos varias contaminaciones en los controles negativos, por lo que pospusimos el reinicio del proyecto para este segundo semestre.  A partir de la idea surgida, hemos re-organizado el proyecto y estamos mucho mejor preparados y enfocados para el mismo, luego de alterar algunos procedimientos y protocolos.
·         ¿Qué nuevas técnicas planifico desarrollar? 
                     En cuanto a técnicas, siguen siendo mayormente las mismas: extracciones de DNA (a partir de kits comerciales especializados para extracciones de suelo), PCR (162, Integrasas universales, Clases 1, 2 y 3 de integrones) etc.  Lo único distinto es que antes de hacer las extracciones de DNA, utilizamos “blenders” para homogenizar los alimentos en un buffer de NaCl al .85%.  A partir de esto, la solución se agita por 15 minutos a 200 rpm y luego se comienzan a hacer las extracciones regulares.

Resultados hacia la recta final.

Este semestre pude terminar la primera parte de mi proyecto.  La misma estaba basada en un estudio (“screening”) de integrones bacterianos a través de todo Puerto Rico, específicamente en muestras tomadas de arena de playa, aguas de plantas de tratamiento y suelo de bosques/ zonas rurales y urbanas.  Detectamos en nuestra investigación integrones clase 1 y clase 2 a través de toda la isla en frecuencias signifcativamente altas (recordando que integrones clase 1-3 son elementos genéticos que confieren resistencia a antibióticos).  Detectamos también integrones clínicos clase 3, aunque con una frecuencia menor.  Los mismos no habían sido detectados nunca antes en Puerto Rico, y los encontramos únicamente en el área de Adjuntas.  También recopilamos las secuencias de las integrasas muestradas (de las tres clases).  Entre estas (todavía en proceso de análisis) entendemos que tenemos integrasas noveles, específicamente de clase 3.

En cuanto a mi segundo proyecto, he estado trabajando haciendo un “screening”, o un estudio para detectar la presencia de integrones bacterianos en yogurts orgánicos comerciales.  Hasta este punto, hemos podido extraer DNA de los yogurts, fácilmente.  Amplificamos el 16s, por lo que confirmamos que el DNA era amplificable y procedimos a la búsqueda de integrones.  Recientemente pudimos amplificar integrasas universales en este DNA, lo que nos dice que existe alguna de las 9 clases de integrones bacterianos en ese DNA.  En este momento nos encontramos en el proceso de amplificar las clases específicas de integrones (1-3), para con eso poder determinar si hay integrones de resistencia a a anitbióticos en estos productos comerciales comestibles.  De ser así esto resultaría amenazante como fuente de dispersión oral.

El progreso que ha logrado con relación a las metas establecidas en agosto 2008 lo catalogaría del 1-5 en un #4.

He logrado superar mis planes para con las librerías y secuenciaciones de los integrones clase 1, 2 y 3 en específico.  Actualmente siento que he vuelto a comenzar desde el principio, ya que hace un par de semanas se unió a nuestro equipo de investigación (oficialmente en el laboratorio) una estudiante subgraduada adicional.  Junto a ella, hemos comenzado a desarrollar una nueva ventana de nuestro proyecto:  la búsqueda de integrones bacterianos en productos lácteos.  A este momento le he ido enseñando a la estudiante las técnicas más importantes de laboratorio y hemos dado inicio al “screening” y esperamos ir desarrollando esta parte del proyecto, en especial durante el prícimo semestre.

El enfoque principal de nuestra investigación es utilizar métodos independientes de cultivo para poder adentrarnos en la ecología molecular de los integrones y de esta forma comprender como las reservas ambientales pueden agravar el problema de resistencia a antibióticos.

A continuación presento algunas de las conclusiones (según declaradas a Sea-Grant UPRM) de enero-octubre 2008.

· Clinical class 1 integrons were detected in sewage, wastewater treatment plant effluents and in sand from beaches with a history of anthropogenic impact. 

· Our preliminary screening detected 7 novel integrase genotypes and 3 variants, closely related to class 1 elements.

 - Class 2 integrases were detected with less consistency in undisturbed environment relative to those with anthropogenic  impact.

- To our knowledge, class 3 integrase genes (intI3 ) were detected  in  Puerto Rico for the first time, and only associated with effluents from a rural wastewater treatment plants.

Técnica de Extracción de DNA por Membrana:

En nuestro proyecto utilizamos muestras de DNA ambientales para escanear la presencia de integrones clínicos en distintos lugares a través de la Isla.  A principios de nuestra investigación fue sumamente difícil poder optimizar los protocolos de DNA.  Esto se debía a que las muestras de aguas que traíamos al laboratorio, había que concentrarle el pellet de 50ml a 1ml.  Con todo y esto, las extracciones no siempre producían suficiente DNA.  Con estas experiencias, decidimos que cPomprando equipo de filtración y filtrando las muestras de agua en membranas, podríamos obtener consistentemente muestras de DNA ambiental. 

Para comenzar ésta técnica, se tomaron las muestras ambientales de agua de plantas de tratamiento y de arena de diferentes playas.  Para las muestras de playas se resuspendía la arena en agua por unos minutos y luego se tomaba el sobrenadante para filtrarlo.  El equipo de filtración se autoclaveó antes de ser usado, al igual que los materiales para manejar las membranas.  Luego de filtrar las muestras, se tomaban las membranas y se colocaban en tubos de hacer extracción de DNA por método de “bead beating”.  De aquí en adelante la extracción continuaba de forma rutinaria (añadiendo los respectivos buffers, y material para purificar el DNA).  Cuando corrímos las geles se pudieron observar bandas de DNA muy bien marcadas, en todas las muestras.  De este procedimiento conclímos que extraer DNA por membranas es un método mucho más efectivo para las muestras ambientales que estábamos recolectando.

Utilizando una escala del 1-5 el progreso de mi investigación calificaría bajo un 4 (mucho progreso, he logrado al menos 80% de los objetivos).

De las metas establecidas, se lograron secuenciar 56 clones de los integrones de clases 1 y 2.  Esta data se encuentra bajo inspección de nuestro mentor, el Dr. Carlos Rodriguez para el analisis de la misma.  Hemos también expandido la búsqueda de integrones clase 3, y los encontramos en el área de Adjuntas.  Estos se clonaron y están listos para enviar a secuenciar próximamente.  Todavía no hemos comenzado con el multiplex-PCR, porque hemos decidido hacer un screening de los genes cassettes presentes en los numerosos integrones que ya hemos recolectado.  Esta es la etapa actual de nuestro trabajo de investigación.     

• ¿Qué dificultades ha afrontado en relación a sus metas? ¿Qué ha hecho para atenderlas?

No hemos presentado muchas dificultades con nuestros trabajos recientemente.  Lo único que mencionaría es que necesitamos que se nos entrene con el uso de la máquina de Multi-plex PCR y por ésta razón lo hemos pospuesto para cuando se nos pueda atender.  En mi opinión lo más que nos dificulta el poder avanzar al ritmo que quisiéramos son las clases.  Yo, por ejemplo tengo 19 créditos, y aunque quisiera estar en el laboratorio más tiempo, no siempre es posible.  Para esto he decidido hacer un itinerario y seguirlo al pie de la letra, administrando bien el tiempo

Pesquisa contra el Hospital San Lucas

Procuradora del Paciente ordena investigar muertes a causa de una infección bacteriana en el centro de salud ponceño.

SAN JUAN - La procuradora del Paciente, Luz Teresa Amador, ordenó investigar la alegada muerte de pacientes a causa de una infección bacteriana contraída en el Hospital San Lucas de Ponce.

Amador indicó hoy que personal de su oficina se trasladó desde temprano a inspeccionar la instalación hospitalaria, donde al menos 28 pacientes han contraído la bacteria klebsiella pneumoniae.

11 septiembre 2008 10:14PM| Dr. Jayuya

http://www.youtube.com/watch?v=0wKt9s8oZu0 http://www.youtube.com/watch?v=LuNsgxJjzzg&feature=user

“Urge conocer muchos detalles sobre esta lamentable situación que ha puesto en riesgo la salud y la vida de cientos de pacientes que acuden a este hospital. Queremos saber, entre otras, qué hizo la institución cuando se enteró del primer caso y cuáles fueron las acciones tomadas”, expresó en un comunicado.

El director ejecutivo de la institución hospitalaria, Guillermo Martin, ha reconocido que cinco pacientes contagiados murieron, pero alega fue a causa de enfermedades como VIH y cáncer.

La bacteria, que no es peligrosa para personas saludables, puede representar un riesgo para pacientes con el sistema inmunológico debilitado.

Amador señaló que la Procuraduría Auxiliar de Asuntos Legales de la Oficina de la Procuradora del Paciente (OPP) emitió el miércoles un requerimiento de información.

La funcionaria exhortó a la población a mantener la calma y tomar todas las medidas preventivas para evitar el contagio.

“Los pacientes y sus familiares deben estar muy atentos a la información oficial, de manera que puedan estar mejor informados y tomar las decisiones correctas en el momento correcto. Por el momento, nuestra oficina continuará vigilante y realizando una investigación minuciosa”, añadió.

La epidemióloga del Estado, Enid García Rivera, no descartó el miércoles el cierre de la institución como medida extrema si la situación sigue complicándose.

“Se puede dar ese escenario (el cierre del hospital), aunque sería la medida más extrema, pero sí es algo que pudiese darse. Si no se da una disminución de casos en cierto periodo de tiempo, ésa pudiera ser una posibilidad”, dijo García Rivera tras advertir que para tratar la bacteria podría usarse más de un antibiótico por la resistencia notable que ha mostrado.

Desde abril ya había contagio

viernes, 12 de septiembre de 2008
Actualizado hace 17 horas
(00:00 a.m. )

Sara M. Justicia Doll / Primera Hora

Error craso.

El hospital Episcopal San Lucas II de Ponce había comenzado a reportar casos de contagio con la peligrosa bacteria Klebsiella pneumoniae desde abril. Lo trabajaron con epidemiólogos internos y no fue hasta el jueves pasado que el Departamento de Salud fue advertido de lo que en efecto es un brote de esta bacteria que conlleva notificación pública.

Así lo dejó saber la secretaria de Salud, Rosa Pérez Perdomo, mientras participaba de la Primera Cumbre Interagencial Sobre Violencia en Niños, Adolescentes y Adultos, que se celebró ayer en el hotel Condado Plaza.

“Cuando un hospital comienza a reportar casos, de dos en dos, o de tres en tres con cierta frecuencia… no puede esperar para reportar lo que puede ser un brote. Esperaron que los niveles de esa bacteria excedieran lo esperado para entonces reportarlo a nuestra institución”, sentenció la titular de Salud.

La funcionaria indicó que actualmente se está consultando con la oficina de reglamentación de Salud para indagar sobre las penalidades que pudiera enfrentar el hospital San Lucas II por no proceder de acuerdo con la política pública en este asunto.

La epidemióloga del Estado, Enid García Rivera, informó que, de no poder tratarse efectivamente con antibióticos y curar a los pacientes afectados, no se descartaría la posibilidad de cerrar la institución clínica.

Según ha reportado PRIMERA HORA, los síntomas provocados por la bacteria Klebsiella pneumoniae pudieran incluir fiebre, escalofríos, tos, pulmonía, infección del tracto urinario, síntomas parecidos a la influenza, flema espesa y con sangre y afectar sobre todo a personas que presentan un sistema inmunológico débil.

Este tipo de pacientes pueden ser personas que sufran de cáncer, sida, envejecientes y niños.

Creen bacteria lo mató

viernes, 12 de septiembre de 2008
Actualizado hace 16 horas
(00:00 a.m. )

Ponce.- Murió de una bacteria devastadora y “sin nombre”. David González era un consumado atleta de 36 años, padre de dos niñas, profesor de voleibol y sóftbol, jugador de baloncesto y bolos, que nunca había necesitado hospitalización.

El pasado 11 de agosto fue admitido en el hospital Episcopal San Lucas con síntomas de resfrío, escalofríos y fiebre, según sus parientes. Unos 18 días mas tarde falleció de causas aún no confirmadas. Se supo que a su llegada al mayor centro hospitalario ponceño médicos le detectaron una obstrucción intestinal que obligó a pasarlo al área de emergencia para realizarle algunas pruebas.

Poco después se estableció que padecía de pulmonía pero tuvo que esperar casi tres días por un cuarto, fuera del área de emergencia. Cindy Montijo, viuda de González, afirmó que a su esposo se le trató con antibióticos desde que fue ingresado pero debió ser transferido a intensivo. Una mancha en el pulmón reveló la presencia de una bacteria. “El doctor que lo atendía informó que se trataba de una bacteria devastadora para la cual no tenían el nombre, no estaba identificada, que se le iban a hacer los cultivos para poder identificarla”, dijo la viuda.

Pasaron varios días sin que se revelara el resultado de esos cultivos y se entubó al paciente mientras el hospital rechazó permitir un cambio a otro hospital, aduciendo que mientras hicieran bien las cosas, no lo autorizarían. “Llegó a tener de 6 a 7 antibióticos diariamente. Me indicaban que la bacteria estaba resistente y empezó a empeorar con el ventilador”, narró Montijo al sostener que se le indicaba que todo estaba bajo control.

“Se le preguntó si esos cultivos se estaban enviando a otro lugar fuera de Puerto Rico. Dijeron que no, que se estaban manejando en el mismo hospital. Se les recomendó que se buscara ayuda a través del centro de control de infecciones en Atlanta… las personas me indicaron que todo estaba bajo control”, agregó Montijo.

Para el 28 de agosto, los médicos indicaron a la familia que David estaba estable y que los resultados de los cultivos tardarían mas días pero a las 6:00 de la mañana siguiente le informaron que él había fallecido.

Heriberto Montijo, cuñado del infortunado, agregó que el hospital se ofreció a practicar la autopsia por lo que no se refirió el cadáver al Instituto de Ciencias Forenses (ICF) pero los resultados no les han sido revelados. Ambos familiares denunciaron que, contrario a las medidas que el hospital anunció que tomó para prevenir que se esparciera la bacteria, nunca vieron nada que protegiera a González a pesar de que la bacteria se había detectado meses antes en la institución. “Desperdicios se vieron en el pasillo en el área de intensivo donde eran transportados diariamente a todas horas, sin las protecciones debidas”, dijo la viuda. Sostuvieron también que cuando preguntaron si se podrían contagiar con la bacteria, se les informó que no a pesar que según las autoridades del Hospital se puede transmitir por contacto físico. “Era una persona totalmente productiva, David no fumaba, no bebía, David siempre estaba en relación con sus hijas y con su esposa toda la semana”, lamentó el cuñado.

Mientras tanto, investigadoras asignadas por la procuradora del Paciente, Luz T. Amador, accedieron ayer a los 28 expedientes de las personas que, según el hospital, adquirieron la Klebsiella Pneumoniae, una bacteria muy peligrosa que se activa con la falta de higiene en personas con su sistema inmunológico debilitado.

Las doctoras Niurka Rosado y María Guzmán indicaron que prepararán un informe de todo hallazgo que conduzca a un posible mal manejo de los pacientes aunque no quisieron adelantar ningún resultado. “Pedimos los expedientes de los pacientes que fueron detectados y vamos a evaluarlos… toda la información”, indicó Rosado, quien explicó que la evaluación se hace en el mismo hospital al tiempo que otros compañeros suyos realizaban una inspección del área donde se atienden a otros pacientes afectados por la peligrosa bacteria. “Se le pide (al hospital) los expedientes de los 28 pacientes que ha dicho la prensa pero también otra información… si hay más eventualmente lo sabremos”, agregó Guzmán. Recalcaron que toda decisión legal posterior estará en manos de la procuradora aunque sostuvieron que el hospital ha colaborado con sus peticiones.

APOYEN LAS INVESTIGACIONES PARA MEJORAR ESTE PROBLEMA TAN AMENAZANTE!!!!

-LOS INTEGRONES PUDIERAN ESTAR CONTRIBUYENDO A LA DISPERSION DE LA RESISTENCIA A:

 Klebsiella Pneumoniae

Foto del Hospital San Lucas

 ·         ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

Hemos continuado el proyecto del semestre pasado (el cual hemos llevado continuamente desde agosto 2007).  El pasado descubrimos integrasas nunca antes descritas en el área de Mayaguez y Adjuntas.  También confirmamos la presencia de integrones clase 1 en áreas impactadas con contaminación fecal.  Continuando este proyecto, hemos hecho un nuevo enfoque y estamos buscando los integrones en las playas (comenzando con el área oeste).  Hemos seguido desarrollando este proyecto y ya se han encontrado las tres clases de integrones en muestreos de Mayaguez, Aguadilla, Aguada y Adjuntas.  Estamos secuenciando para describir la data encontrada y hacer un análisis más profundo de lo que hemos encontrado.  El plan presente es expandir la genoteca de clase 3, que nunca antes habíamos encontrado en las muestras tomadas de la isla.

·         ¿ Qué nuevas técnicas planea desarrollar?

Planificamos hacer Multiplex PCR, y esta sería la técnica nueva principal que usaremos.  También estaremos haciendo extracción de DNA de geles. 

Información de trasfondo sobre Multiplex PCR:

<<http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Multiplex_PCR/>>

“Overview: Multiplex PCR is a variant of PCR which enabling simultaneous amplification of many targets of interest in one reaction by using more than one pair of primers. Since its first description in 1988 by Chamberlain et al, this method has been applied in many areas of DNA testing, including analyses of deletions, mutations, and polymorphisms, or quantitative assays and reverse transcription PCR. Typically, it is used for genotyping applications where simultaneous analysis of multiple markers is required, detection of pathogens or genetically modified organisms (GMOs), or for microsatellite analyses. Multiplex assays can be tedious and time-consuming to establish, requiring lengthy optimization procedures.”