El progreso que ha logrado con relación a las metas establecidas en agosto 2008 lo catalogaría del 1-5 en un #4.

He logrado superar mis planes para con las librerías y secuenciaciones de los integrones clase 1, 2 y 3 en específico.  Actualmente siento que he vuelto a comenzar desde el principio, ya que hace un par de semanas se unió a nuestro equipo de investigación (oficialmente en el laboratorio) una estudiante subgraduada adicional.  Junto a ella, hemos comenzado a desarrollar una nueva ventana de nuestro proyecto:  la búsqueda de integrones bacterianos en productos lácteos.  A este momento le he ido enseñando a la estudiante las técnicas más importantes de laboratorio y hemos dado inicio al “screening” y esperamos ir desarrollando esta parte del proyecto, en especial durante el prícimo semestre.

El enfoque principal de nuestra investigación es utilizar métodos independientes de cultivo para poder adentrarnos en la ecología molecular de los integrones y de esta forma comprender como las reservas ambientales pueden agravar el problema de resistencia a antibióticos.

A continuación presento algunas de las conclusiones (según declaradas a Sea-Grant UPRM) de enero-octubre 2008.

· Clinical class 1 integrons were detected in sewage, wastewater treatment plant effluents and in sand from beaches with a history of anthropogenic impact. 

· Our preliminary screening detected 7 novel integrase genotypes and 3 variants, closely related to class 1 elements.

 - Class 2 integrases were detected with less consistency in undisturbed environment relative to those with anthropogenic  impact.

- To our knowledge, class 3 integrase genes (intI3 ) were detected  in  Puerto Rico for the first time, and only associated with effluents from a rural wastewater treatment plants.

Técnica de Extracción de DNA por Membrana:

En nuestro proyecto utilizamos muestras de DNA ambientales para escanear la presencia de integrones clínicos en distintos lugares a través de la Isla.  A principios de nuestra investigación fue sumamente difícil poder optimizar los protocolos de DNA.  Esto se debía a que las muestras de aguas que traíamos al laboratorio, había que concentrarle el pellet de 50ml a 1ml.  Con todo y esto, las extracciones no siempre producían suficiente DNA.  Con estas experiencias, decidimos que cPomprando equipo de filtración y filtrando las muestras de agua en membranas, podríamos obtener consistentemente muestras de DNA ambiental. 

Para comenzar ésta técnica, se tomaron las muestras ambientales de agua de plantas de tratamiento y de arena de diferentes playas.  Para las muestras de playas se resuspendía la arena en agua por unos minutos y luego se tomaba el sobrenadante para filtrarlo.  El equipo de filtración se autoclaveó antes de ser usado, al igual que los materiales para manejar las membranas.  Luego de filtrar las muestras, se tomaban las membranas y se colocaban en tubos de hacer extracción de DNA por método de “bead beating”.  De aquí en adelante la extracción continuaba de forma rutinaria (añadiendo los respectivos buffers, y material para purificar el DNA).  Cuando corrímos las geles se pudieron observar bandas de DNA muy bien marcadas, en todas las muestras.  De este procedimiento conclímos que extraer DNA por membranas es un método mucho más efectivo para las muestras ambientales que estábamos recolectando.

Utilizando una escala del 1-5 el progreso de mi investigación calificaría bajo un 4 (mucho progreso, he logrado al menos 80% de los objetivos).

De las metas establecidas, se lograron secuenciar 56 clones de los integrones de clases 1 y 2.  Esta data se encuentra bajo inspección de nuestro mentor, el Dr. Carlos Rodriguez para el analisis de la misma.  Hemos también expandido la búsqueda de integrones clase 3, y los encontramos en el área de Adjuntas.  Estos se clonaron y están listos para enviar a secuenciar próximamente.  Todavía no hemos comenzado con el multiplex-PCR, porque hemos decidido hacer un screening de los genes cassettes presentes en los numerosos integrones que ya hemos recolectado.  Esta es la etapa actual de nuestro trabajo de investigación.     

• ¿Qué dificultades ha afrontado en relación a sus metas? ¿Qué ha hecho para atenderlas?

No hemos presentado muchas dificultades con nuestros trabajos recientemente.  Lo único que mencionaría es que necesitamos que se nos entrene con el uso de la máquina de Multi-plex PCR y por ésta razón lo hemos pospuesto para cuando se nos pueda atender.  En mi opinión lo más que nos dificulta el poder avanzar al ritmo que quisiéramos son las clases.  Yo, por ejemplo tengo 19 créditos, y aunque quisiera estar en el laboratorio más tiempo, no siempre es posible.  Para esto he decidido hacer un itinerario y seguirlo al pie de la letra, administrando bien el tiempo

Pesquisa contra el Hospital San Lucas

Procuradora del Paciente ordena investigar muertes a causa de una infección bacteriana en el centro de salud ponceño.

SAN JUAN - La procuradora del Paciente, Luz Teresa Amador, ordenó investigar la alegada muerte de pacientes a causa de una infección bacteriana contraída en el Hospital San Lucas de Ponce.

Amador indicó hoy que personal de su oficina se trasladó desde temprano a inspeccionar la instalación hospitalaria, donde al menos 28 pacientes han contraído la bacteria klebsiella pneumoniae.

11 septiembre 2008 10:14PM| Dr. Jayuya

http://www.youtube.com/watch?v=0wKt9s8oZu0 http://www.youtube.com/watch?v=LuNsgxJjzzg&feature=user

“Urge conocer muchos detalles sobre esta lamentable situación que ha puesto en riesgo la salud y la vida de cientos de pacientes que acuden a este hospital. Queremos saber, entre otras, qué hizo la institución cuando se enteró del primer caso y cuáles fueron las acciones tomadas”, expresó en un comunicado.

El director ejecutivo de la institución hospitalaria, Guillermo Martin, ha reconocido que cinco pacientes contagiados murieron, pero alega fue a causa de enfermedades como VIH y cáncer.

La bacteria, que no es peligrosa para personas saludables, puede representar un riesgo para pacientes con el sistema inmunológico debilitado.

Amador señaló que la Procuraduría Auxiliar de Asuntos Legales de la Oficina de la Procuradora del Paciente (OPP) emitió el miércoles un requerimiento de información.

La funcionaria exhortó a la población a mantener la calma y tomar todas las medidas preventivas para evitar el contagio.

“Los pacientes y sus familiares deben estar muy atentos a la información oficial, de manera que puedan estar mejor informados y tomar las decisiones correctas en el momento correcto. Por el momento, nuestra oficina continuará vigilante y realizando una investigación minuciosa”, añadió.

La epidemióloga del Estado, Enid García Rivera, no descartó el miércoles el cierre de la institución como medida extrema si la situación sigue complicándose.

“Se puede dar ese escenario (el cierre del hospital), aunque sería la medida más extrema, pero sí es algo que pudiese darse. Si no se da una disminución de casos en cierto periodo de tiempo, ésa pudiera ser una posibilidad”, dijo García Rivera tras advertir que para tratar la bacteria podría usarse más de un antibiótico por la resistencia notable que ha mostrado.

Desde abril ya había contagio

viernes, 12 de septiembre de 2008
Actualizado hace 17 horas
(00:00 a.m. )

Sara M. Justicia Doll / Primera Hora

Error craso.

El hospital Episcopal San Lucas II de Ponce había comenzado a reportar casos de contagio con la peligrosa bacteria Klebsiella pneumoniae desde abril. Lo trabajaron con epidemiólogos internos y no fue hasta el jueves pasado que el Departamento de Salud fue advertido de lo que en efecto es un brote de esta bacteria que conlleva notificación pública.

Así lo dejó saber la secretaria de Salud, Rosa Pérez Perdomo, mientras participaba de la Primera Cumbre Interagencial Sobre Violencia en Niños, Adolescentes y Adultos, que se celebró ayer en el hotel Condado Plaza.

“Cuando un hospital comienza a reportar casos, de dos en dos, o de tres en tres con cierta frecuencia… no puede esperar para reportar lo que puede ser un brote. Esperaron que los niveles de esa bacteria excedieran lo esperado para entonces reportarlo a nuestra institución”, sentenció la titular de Salud.

La funcionaria indicó que actualmente se está consultando con la oficina de reglamentación de Salud para indagar sobre las penalidades que pudiera enfrentar el hospital San Lucas II por no proceder de acuerdo con la política pública en este asunto.

La epidemióloga del Estado, Enid García Rivera, informó que, de no poder tratarse efectivamente con antibióticos y curar a los pacientes afectados, no se descartaría la posibilidad de cerrar la institución clínica.

Según ha reportado PRIMERA HORA, los síntomas provocados por la bacteria Klebsiella pneumoniae pudieran incluir fiebre, escalofríos, tos, pulmonía, infección del tracto urinario, síntomas parecidos a la influenza, flema espesa y con sangre y afectar sobre todo a personas que presentan un sistema inmunológico débil.

Este tipo de pacientes pueden ser personas que sufran de cáncer, sida, envejecientes y niños.

Creen bacteria lo mató

viernes, 12 de septiembre de 2008
Actualizado hace 16 horas
(00:00 a.m. )

Ponce.- Murió de una bacteria devastadora y “sin nombre”. David González era un consumado atleta de 36 años, padre de dos niñas, profesor de voleibol y sóftbol, jugador de baloncesto y bolos, que nunca había necesitado hospitalización.

El pasado 11 de agosto fue admitido en el hospital Episcopal San Lucas con síntomas de resfrío, escalofríos y fiebre, según sus parientes. Unos 18 días mas tarde falleció de causas aún no confirmadas. Se supo que a su llegada al mayor centro hospitalario ponceño médicos le detectaron una obstrucción intestinal que obligó a pasarlo al área de emergencia para realizarle algunas pruebas.

Poco después se estableció que padecía de pulmonía pero tuvo que esperar casi tres días por un cuarto, fuera del área de emergencia. Cindy Montijo, viuda de González, afirmó que a su esposo se le trató con antibióticos desde que fue ingresado pero debió ser transferido a intensivo. Una mancha en el pulmón reveló la presencia de una bacteria. “El doctor que lo atendía informó que se trataba de una bacteria devastadora para la cual no tenían el nombre, no estaba identificada, que se le iban a hacer los cultivos para poder identificarla”, dijo la viuda.

Pasaron varios días sin que se revelara el resultado de esos cultivos y se entubó al paciente mientras el hospital rechazó permitir un cambio a otro hospital, aduciendo que mientras hicieran bien las cosas, no lo autorizarían. “Llegó a tener de 6 a 7 antibióticos diariamente. Me indicaban que la bacteria estaba resistente y empezó a empeorar con el ventilador”, narró Montijo al sostener que se le indicaba que todo estaba bajo control.

“Se le preguntó si esos cultivos se estaban enviando a otro lugar fuera de Puerto Rico. Dijeron que no, que se estaban manejando en el mismo hospital. Se les recomendó que se buscara ayuda a través del centro de control de infecciones en Atlanta… las personas me indicaron que todo estaba bajo control”, agregó Montijo.

Para el 28 de agosto, los médicos indicaron a la familia que David estaba estable y que los resultados de los cultivos tardarían mas días pero a las 6:00 de la mañana siguiente le informaron que él había fallecido.

Heriberto Montijo, cuñado del infortunado, agregó que el hospital se ofreció a practicar la autopsia por lo que no se refirió el cadáver al Instituto de Ciencias Forenses (ICF) pero los resultados no les han sido revelados. Ambos familiares denunciaron que, contrario a las medidas que el hospital anunció que tomó para prevenir que se esparciera la bacteria, nunca vieron nada que protegiera a González a pesar de que la bacteria se había detectado meses antes en la institución. “Desperdicios se vieron en el pasillo en el área de intensivo donde eran transportados diariamente a todas horas, sin las protecciones debidas”, dijo la viuda. Sostuvieron también que cuando preguntaron si se podrían contagiar con la bacteria, se les informó que no a pesar que según las autoridades del Hospital se puede transmitir por contacto físico. “Era una persona totalmente productiva, David no fumaba, no bebía, David siempre estaba en relación con sus hijas y con su esposa toda la semana”, lamentó el cuñado.

Mientras tanto, investigadoras asignadas por la procuradora del Paciente, Luz T. Amador, accedieron ayer a los 28 expedientes de las personas que, según el hospital, adquirieron la Klebsiella Pneumoniae, una bacteria muy peligrosa que se activa con la falta de higiene en personas con su sistema inmunológico debilitado.

Las doctoras Niurka Rosado y María Guzmán indicaron que prepararán un informe de todo hallazgo que conduzca a un posible mal manejo de los pacientes aunque no quisieron adelantar ningún resultado. “Pedimos los expedientes de los pacientes que fueron detectados y vamos a evaluarlos… toda la información”, indicó Rosado, quien explicó que la evaluación se hace en el mismo hospital al tiempo que otros compañeros suyos realizaban una inspección del área donde se atienden a otros pacientes afectados por la peligrosa bacteria. “Se le pide (al hospital) los expedientes de los 28 pacientes que ha dicho la prensa pero también otra información… si hay más eventualmente lo sabremos”, agregó Guzmán. Recalcaron que toda decisión legal posterior estará en manos de la procuradora aunque sostuvieron que el hospital ha colaborado con sus peticiones.

APOYEN LAS INVESTIGACIONES PARA MEJORAR ESTE PROBLEMA TAN AMENAZANTE!!!!

-LOS INTEGRONES PUDIERAN ESTAR CONTRIBUYENDO A LA DISPERSION DE LA RESISTENCIA A:

 Klebsiella Pneumoniae

Foto del Hospital San Lucas

 ·         ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

Hemos continuado el proyecto del semestre pasado (el cual hemos llevado continuamente desde agosto 2007).  El pasado descubrimos integrasas nunca antes descritas en el área de Mayaguez y Adjuntas.  También confirmamos la presencia de integrones clase 1 en áreas impactadas con contaminación fecal.  Continuando este proyecto, hemos hecho un nuevo enfoque y estamos buscando los integrones en las playas (comenzando con el área oeste).  Hemos seguido desarrollando este proyecto y ya se han encontrado las tres clases de integrones en muestreos de Mayaguez, Aguadilla, Aguada y Adjuntas.  Estamos secuenciando para describir la data encontrada y hacer un análisis más profundo de lo que hemos encontrado.  El plan presente es expandir la genoteca de clase 3, que nunca antes habíamos encontrado en las muestras tomadas de la isla.

·         ¿ Qué nuevas técnicas planea desarrollar?

Planificamos hacer Multiplex PCR, y esta sería la técnica nueva principal que usaremos.  También estaremos haciendo extracción de DNA de geles. 

Información de trasfondo sobre Multiplex PCR:

<<http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Multiplex_PCR/>>

“Overview: Multiplex PCR is a variant of PCR which enabling simultaneous amplification of many targets of interest in one reaction by using more than one pair of primers. Since its first description in 1988 by Chamberlain et al, this method has been applied in many areas of DNA testing, including analyses of deletions, mutations, and polymorphisms, or quantitative assays and reverse transcription PCR. Typically, it is used for genotyping applications where simultaneous analysis of multiple markers is required, detection of pathogens or genetically modified organisms (GMOs), or for microsatellite analyses. Multiplex assays can be tedious and time-consuming to establish, requiring lengthy optimization procedures.”

Para este semestre hemos propuesto trabajar con una genoteca de integrones clase 3.  Los mismos fueron econtrados en muestras del pueblo de Adjuntas.  Nuestros planes para este semestre, son desarrollar ésta y otras genotecas, y identificar cualitativamente las secuencias de los clones que se han extraído de integrones clase 1, 2 y 3.  En estas primeras semanas de clase, resucitamos clones de clase 2 y se prepararon para enviar a secuenciar.

Para este semestre espero haber logrado:

-La secuenciación de 56 clones de los integrones de clases 1 y 2.

-Análisis de las secuenciaciones

-Expandir los experimentos en busqueda de integrones clase 3 a través de la isla, en especial en el área de Adjuntas.

-Secuenciar los clones de Adjuntas, y analizar los datos obtenidos

-Multiplex PCR (planes futuros para mediados/fin de semestre)

VERANO 2008

Este verano tuve la oportunidad de trabajar haciendo investigación en Harvard Medical School, como parte del programa SHURP.  Estuve en el Departamento de Rheumatología, Immunología y Alergias, con el Dr. Michael Brenner.  El laboratorio en el que trabajé contribuye con investigación en la patofisiología de artritis rheumatoide.  Me interesó muchísimo el tema, ya que mi madre ha padecido de la enfermedad por más de 25 años y una de mis mejores amigas fue diagnosticada, hace solo algunos meses.

En el laboratorio del Dr. Brenner, se encontró recientemente una proteina de adhesión de las células FLS (“fibroblast like synoviocytes”) la cual fue identificada como “cadherin-11” (cad-11).  Ellos pudieron probar que (cad-11) tiene un rol importante en la inflamación de pacientes con artritis rheumatoide (AR).  Experimentos previos a mi trabajo de verano fueron hechos, utilizando un modelo con ratones.  Como resultado de este modelo se demostró que en grupos de ratones en los cuales se inducía AR la presencia o ausencia  de esta molécula causaba cambios significativos en la inflamación y la erosión de cartílago.  Específicamente la ausencia de la proteína de adhesión disminuía la inflamación de un 30-50% y eliminaba casi por completo la erosión de cartílago.  Estos resultados fueron emocionantes, ya que en la tercera etapa de AR los pacientes experimentan un alto grado de inflamación y erosión de el cartílago y de los huesos.

Aunque los anti-cad11 actualmente se están movilizándo a “clinical trials”, el laboratorio deseaba poder simular la erosión de cartilago in-vitro, para poder hacer experimentos con la eliminación de la actividad de cad-11 (ya que el modelo in-vivo fue exitoso).  Aquí entró el tema para mi proyecto por el verano, que fue desarrollar un protocolo in-vitro para examinar el rol de cad-11 en la erosión de cartílago.

Para el desarrollo utilizamos cartilago de vaca, lo cortamos uniformemente en discos de 5mm de diámetro y los incubamos en presencia de células FLS (las cuales degradan el cartílago).  La erosión del cartílago fue medida por la presencia de glicosaminoglicanos en el medio en el que se suspendían las células y con el que se cubría el cartílago.  Como los glicosaminoglicanos son un componente importante del cartílago, y su presencia en el medio, es indicativo de que hubo erosión.  En los experimentos que hicimos, estudiamos el medio despues de la incubación obtuvimos resultados en los que se demostró la erosión, pero lamentablemente encontramos que de igual forma había erosión en los controles negativos (en los cuales solo se incubó el cartilago solo, sin las células degradadoras).  Por este motivo se sugirió como estudio futuro, utilizar otra forma para medir la erosión del cartílago.  Como alternativa una ELISA para colágeno tipo II que mide uno los productos de la degradación de colágeno, podría demostrar una forma alterna de medir cuantitativamente la erosión del cartílago (ya que el colágeno es un componente importante de la estructura del cartílago. 

 ¿Qué he aprendido?