BioMinds – Research Day……Evaluaciones

#1

Nombre del estudiante investigador:   Rocío Rivera Valentín

Título del Proyecto: 

Generation and Screening of Metagenomic libraires from a tropical forest in Puerto Rico: searching for novel enzymatic capabilities.

 El trabajo de ésta estudiante enfocaba dos objetivos principales.  En primer lugar la utilización de bibliotecas metagenómicas de pequeño tamaño (hechas con muestras de suelo del Pico del Yunque de PR.  En segundo lugar el estudio detallado de dichas bibliotecas para la verificación de capacidades enzimáticas. 

En cuanto a la primera parte, Rocío logró extraer DNA de sus muestras de suelo, y las trató con endonucleasas para que los fragmentos fueran excisados, purificados, clonados a un vector y transformados a E. coli. De esto obtuvo varios clones, los cuales aisló para procederle a efectuar distintos experimentos.  En la segunda parte se estudiaron bibliotecas metagenómicas previamente creadas por su laboratorio, y les hizo un “screening” de actividad de proteasas, que resultó en posibles clones que próximamente se identificarán.

Entre sus planes futuros está la busqueda de actividad de DNAsas y el análisis de secuencias para la detección de otras secuencias enzimáticas. 

Estudiante de Carlos Ríos Ph.D at UPRM

Estudiante de Carlos Ríos Ph.D at UPRM

 

#2

Nombre del estudiante investigador:   Jose G Montoyo

Título del Proyecto:  

Applying T7 phage display as a chemical combinatorial approach to search for specific biomarkers.

 El trabajo de éste estudiante trataba sobre la técnica “phage display”, la cual es un método para el estudio de interacciones que utilizan bacteriófagos para conectar proteínas con la información genética que las codifica.  Incluye interacciones tanto proteína-proteína, proteína-péptido y proteína-DNA.

El propósito de Montoyo, era emplear el método en éste proyecto para encontrar un biomarcador específico, y su especificidad por el ligando utilizando un alcanze químico combinatorial.  Para hallar el biomarcador, el estudiante llevó a cabo una serie de “biopannings” o lavados que consisten en separar los fagos enlazados de los no-enlazados.  Como punto interesante, en su investigación no es una molécula o una proteína lo que sirve como ligando, en cambio es toda una célula.  Dirigió sus intenciones a encontrar un biomarcador específico para Staphylococcus aureus y a examinar la especificidad de dos péptidos encontrados en investigaciones previas de Cryptococcus gattii.

Como resultados, luego de dos rondas de “biopanning” varios fagos fueron obtenidos para el aislamiento de biomarcadores específicos.  Montonyo también demostró resultados pasados C. gattii.

En experimentos futuros el estudiante espera el análisis in silico de los fagos aislados contra S. aureus, para determinar la identidad molecular de un posible biomarcador.

dsc00433

 

#3

Nombre del estudiante investigador:   Aslin M. Rodriguez-Nassif

Título del Proyecto: 

Methodology to assess the inhibition of α-Amylase by Tapeinochilus ananassae extracts.

 El trabajo de ésta estudiante trataba sobre la utilización de una planta para pacientes diabéticos y sus posibles efectos.  Su estudio fue basado en el análisis de que la obesidad es una variable importante en la diabetes y que para el manejo de la misma se ha sugerido como estrategia la inhibición de α-amilasa para reducir los niveles de azúcar en la sangre.  Utilizó la planta Tepeinochilus ananassae, en la cual examinó la inhibición de la enzima por extractos acuosos y metanólicos.  También hizo extractos con el flavonoide Quercetin y acarbosa (controles).  Con los extractos se calculó el porciento de inhibición de α-amilasa y se encontró que los extractos acuosos y metanólicos tuvieron una relación inversa en cuanto a la respuesta de inhibición enzimática (medida por concentración). 

Conclusiones de la estudiante:  la inhibición de α-amilasa no es un acercamiento terapéutico útil para el control de la diabetes. 

dsc00432

FEBRERO 2009

Partiendo del mes pasado (donde comenzé un nuevo proyecto) he logrado un progreso intermedio de al menos 50% del trabajo propuesto.  Me encuentro trabajando por el momento con los yogurts comerciales.  He podido extraer DNA de ellos de forma eficiente y amplifiqué el gen 16s rDNA. 

                         Info:   GEN 16s rDNA

                                                 Este gen contiene unas regiones altamente conservadas (efectivas para adición de primers),    pero de igual forma contiene regiones hipervariables que pueden proveer las identidades específicas de bacterias, lo que es útil para su identificación.  Como resultado este gen es altamente útil en la microbiología médica como una alternativa efectiva para métodos fenotípicos de identificación bacteriana.

La amplificación del 16s rDNA nos confirmó que el DNA contenido en los yogurts era amplificable y más que frutal de contenido bacteriano.  A partir de aquí nos movimos a amplificar para detectar la presencia de integrón clase 1 (intl 1).  De las cuatro muestras de yogurts comerciales (Food Club, Activia, Yo-Plait y Pascual), detectamos la presencia de integrón clase 1 en todas.  Con estos resultados ya confirmados, procedimos a concentrar el producto de PCR y hacer extracción del DNA concentrado.  Esto se llevó a cabo utilizando el protocolo de extracción por gel.  En este momento tenemos el DNA listo para proceder con la reacción de ligación y el proceso de clonación para la creación de la genoteca.

 

DIFICULTADES …y resoluciones.

La mayor dificultad durante este proceso ha sido que hemos tenido algunas alicuotas de reactivos de PCR contaminadas, lo que ha resultado en la amplificación constante del control negativo en nuestras muestras.  Para esto cojimos los tubos de “stock” e hicimos alicuotas nuevas para los reactivos principales (buffer, MgCl2, dNTP’s, BSA, Taq y H2O).

 

 

ABSTRACT:

Probing for clinical integrons in yogurt bacteria.

Integrons are a diverse and ancient bacterial genetic platform which facilitates the capture and expression of genes encoding a variety of adaptive functions, including resistance against antibiotics of medical and veterinary importance. Although these genetic elements are known to be horizontally transferred and commonly found among intestinal bacteria of clinical significance, little is known about alternative dispersal routes outside the clinical scene.  Since the prevalence of clinical integrons (classes 1, 2 and 3) in harmless or beneficial bacteria is an understudied subject and bacteria associated with processed milk products have been recently reported to survive transit in the human intestinal tract, we hypothesize that inconspicuous  carriers of clinical integrons may enter the intestinal niche through the food chain. To test this hypothesis we have applied molecular, culture independent methods for the detection of clinical integrons among bacterial populations present in commercial yogurt. We have extracted DNA from eight samples of four different brands and detected the presence of bacterial DNA and class 1 integron in all four of them, using primers specific for the 16SrRNA and intl1 loci.  We are also screening for the presence of antibiotic resistance mechanisms encoded by class 1 integrons and testing for the occurrence of class 2 and class 3 elements. By expanding the extant view of reservoirs of clinical integrons we expect to better understand and attenuate risks related to the emergence of antibiotic resistance due to the misuse of these drugs.

ENERO 2009 – Nuevo proyecto!

Propuesta de investigación para el semestre:

         Siendo éste mi último semestre de investigación subgraduada, he sido asignada con un proyecto a corto plazo, dirigido o encaminado mayormente al área de microbiología de alimentos (y algo de ecología microbiana).  Hemos propuesto (mi mentor y yo), hacer algunas pruebas con alimentos selectivos, en las que verifiquemos la presencia de integrones bacterianos resistentes a antibióticos.  Para dar comienzo a ésto, hemos escogido “Yogurts” comerciales con alta cantidad de probióticos (carga microbiana para regenerar la flora intestinal) y queso de hoja hecho en Puerto Rico.  Nuestro objetivo es identificar si la resistencia a antibióticos mediada por integrones, ha ido en aumento por auto-ingestión vía oral.

o   Metas a alcanzar al final de este semestre:

                    Espero haber logrado …
§  (1)…Extraer DNA bacteriano de los comestibles comerciales seleccionados
§  (2)…Una amplificación positiva del DNA bacteriano a partir del 16S
§  (3)…Ejecución de PCR’s para detectar la presencia de integrones clínicos clase 1, 2 y 3 (una vez se haya detectado la presencia de los genes de integrasas universales por la misma técnica)
§  (4)…A partir de los resltados que se obtengan en el transcurso del semestre, estudiar algún otro alimento, o inferir conclusiones objetivas a partir de nuestras predicciones.

·         ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

                    El semestre pasado trabajé mayormente con muestras ambientales, a las que les hacía pruebas moleculares para detectar la presencia de integrones bacterianos clínicos.  Aunque comenzamos a trabajar con yogurts, y la búsqueda de los integrones en los mismos, tuvimos varias contaminaciones en los controles negativos, por lo que pospusimos el reinicio del proyecto para este segundo semestre.  A partir de la idea surgida, hemos re-organizado el proyecto y estamos mucho mejor preparados y enfocados para el mismo, luego de alterar algunos procedimientos y protocolos.
·         ¿Qué nuevas técnicas planifico desarrollar? 
                     En cuanto a técnicas, siguen siendo mayormente las mismas: extracciones de DNA (a partir de kits comerciales especializados para extracciones de suelo), PCR (162, Integrasas universales, Clases 1, 2 y 3 de integrones) etc.  Lo único distinto es que antes de hacer las extracciones de DNA, utilizamos “blenders” para homogenizar los alimentos en un buffer de NaCl al .85%.  A partir de esto, la solución se agita por 15 minutos a 200 rpm y luego se comienzan a hacer las extracciones regulares.