Partiendo del mes pasado (donde comenzé un nuevo proyecto) he logrado un progreso intermedio de al menos 50% del trabajo propuesto. Me encuentro trabajando por el momento con los yogurts comerciales. He podido extraer DNA de ellos de forma eficiente y amplifiqué el gen 16s rDNA.
Info: GEN 16s rDNA
Este gen contiene unas regiones altamente conservadas (efectivas para adición de primers), pero de igual forma contiene regiones hipervariables que pueden proveer las identidades específicas de bacterias, lo que es útil para su identificación. Como resultado este gen es altamente útil en la microbiología médica como una alternativa efectiva para métodos fenotípicos de identificación bacteriana.
La amplificación del 16s rDNA nos confirmó que el DNA contenido en los yogurts era amplificable y más que frutal de contenido bacteriano. A partir de aquí nos movimos a amplificar para detectar la presencia de integrón clase 1 (intl 1). De las cuatro muestras de yogurts comerciales (Food Club, Activia, Yo-Plait y Pascual), detectamos la presencia de integrón clase 1 en todas. Con estos resultados ya confirmados, procedimos a concentrar el producto de PCR y hacer extracción del DNA concentrado. Esto se llevó a cabo utilizando el protocolo de extracción por gel. En este momento tenemos el DNA listo para proceder con la reacción de ligación y el proceso de clonación para la creación de la genoteca.
DIFICULTADES …y resoluciones.
La mayor dificultad durante este proceso ha sido que hemos tenido algunas alicuotas de reactivos de PCR contaminadas, lo que ha resultado en la amplificación constante del control negativo en nuestras muestras. Para esto cojimos los tubos de “stock” e hicimos alicuotas nuevas para los reactivos principales (buffer, MgCl2, dNTP’s, BSA, Taq y H2O).
ABSTRACT:
Probing for clinical integrons in yogurt bacteria.
Integrons are a diverse and ancient bacterial genetic platform which facilitates the capture and expression of genes encoding a variety of adaptive functions, including resistance against antibiotics of medical and veterinary importance. Although these genetic elements are known to be horizontally transferred and commonly found among intestinal bacteria of clinical significance, little is known about alternative dispersal routes outside the clinical scene. Since the prevalence of clinical integrons (classes 1, 2 and 3) in harmless or beneficial bacteria is an understudied subject and bacteria associated with processed milk products have been recently reported to survive transit in the human intestinal tract, we hypothesize that inconspicuous carriers of clinical integrons may enter the intestinal niche through the food chain. To test this hypothesis we have applied molecular, culture independent methods for the detection of clinical integrons among bacterial populations present in commercial yogurt. We have extracted DNA from eight samples of four different brands and detected the presence of bacterial DNA and class 1 integron in all four of them, using primers specific for the 16SrRNA and intl1 loci. We are also screening for the presence of antibiotic resistance mechanisms encoded by class 1 integrons and testing for the occurrence of class 2 and class 3 elements. By expanding the extant view of reservoirs of clinical integrons we expect to better understand and attenuate risks related to the emergence of antibiotic resistance due to the misuse of these drugs.
