Paloma’s Weblog

 ·         ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

Hemos continuado el proyecto del semestre pasado (el cual hemos llevado continuamente desde agosto 2007).  El pasado descubrimos integrasas nunca antes descritas en el área de Mayaguez y Adjuntas.  También confirmamos la presencia de integrones clase 1 en áreas impactadas con contaminación fecal.  Continuando este proyecto, hemos hecho un nuevo enfoque y estamos buscando los integrones en las playas (comenzando con el área oeste).  Hemos seguido desarrollando este proyecto y ya se han encontrado las tres clases de integrones en muestreos de Mayaguez, Aguadilla, Aguada y Adjuntas.  Estamos secuenciando para describir la data encontrada y hacer un análisis más profundo de lo que hemos encontrado.  El plan presente es expandir la genoteca de clase 3, que nunca antes habíamos encontrado en las muestras tomadas de la isla.

·         ¿ Qué nuevas técnicas planea desarrollar?

Planificamos hacer Multiplex PCR, y esta sería la técnica nueva principal que usaremos.  También estaremos haciendo extracción de DNA de geles. 

Información de trasfondo sobre Multiplex PCR:

<<http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Multiplex_PCR/>>

“Overview: Multiplex PCR is a variant of PCR which enabling simultaneous amplification of many targets of interest in one reaction by using more than one pair of primers. Since its first description in 1988 by Chamberlain et al, this method has been applied in many areas of DNA testing, including analyses of deletions, mutations, and polymorphisms, or quantitative assays and reverse transcription PCR. Typically, it is used for genotyping applications where simultaneous analysis of multiple markers is required, detection of pathogens or genetically modified organisms (GMOs), or for microsatellite analyses. Multiplex assays can be tedious and time-consuming to establish, requiring lengthy optimization procedures.”

Para este semestre hemos propuesto trabajar con una genoteca de integrones clase 3.  Los mismos fueron econtrados en muestras del pueblo de Adjuntas.  Nuestros planes para este semestre, son desarrollar ésta y otras genotecas, y identificar cualitativamente las secuencias de los clones que se han extraído de integrones clase 1, 2 y 3.  En estas primeras semanas de clase, resucitamos clones de clase 2 y se prepararon para enviar a secuenciar.

Para este semestre espero haber logrado:

-La secuenciación de 56 clones de los integrones de clases 1 y 2.

-Análisis de las secuenciaciones

-Expandir los experimentos en busqueda de integrones clase 3 a través de la isla, en especial en el área de Adjuntas.

-Secuenciar los clones de Adjuntas, y analizar los datos obtenidos

-Multiplex PCR (planes futuros para mediados/fin de semestre)

VERANO 2008

Este verano tuve la oportunidad de trabajar haciendo investigación en Harvard Medical School, como parte del programa SHURP.  Estuve en el Departamento de Rheumatología, Immunología y Alergias, con el Dr. Michael Brenner.  El laboratorio en el que trabajé contribuye con investigación en la patofisiología de artritis rheumatoide.  Me interesó muchísimo el tema, ya que mi madre ha padecido de la enfermedad por más de 25 años y una de mis mejores amigas fue diagnosticada, hace solo algunos meses.

En el laboratorio del Dr. Brenner, se encontró recientemente una proteina de adhesión de las células FLS (“fibroblast like synoviocytes”) la cual fue identificada como “cadherin-11” (cad-11).  Ellos pudieron probar que (cad-11) tiene un rol importante en la inflamación de pacientes con artritis rheumatoide (AR).  Experimentos previos a mi trabajo de verano fueron hechos, utilizando un modelo con ratones.  Como resultado de este modelo se demostró que en grupos de ratones en los cuales se inducía AR la presencia o ausencia  de esta molécula causaba cambios significativos en la inflamación y la erosión de cartílago.  Específicamente la ausencia de la proteína de adhesión disminuía la inflamación de un 30-50% y eliminaba casi por completo la erosión de cartílago.  Estos resultados fueron emocionantes, ya que en la tercera etapa de AR los pacientes experimentan un alto grado de inflamación y erosión de el cartílago y de los huesos.

Aunque los anti-cad11 actualmente se están movilizándo a “clinical trials”, el laboratorio deseaba poder simular la erosión de cartilago in-vitro, para poder hacer experimentos con la eliminación de la actividad de cad-11 (ya que el modelo in-vivo fue exitoso).  Aquí entró el tema para mi proyecto por el verano, que fue desarrollar un protocolo in-vitro para examinar el rol de cad-11 en la erosión de cartílago.

Para el desarrollo utilizamos cartilago de vaca, lo cortamos uniformemente en discos de 5mm de diámetro y los incubamos en presencia de células FLS (las cuales degradan el cartílago).  La erosión del cartílago fue medida por la presencia de glicosaminoglicanos en el medio en el que se suspendían las células y con el que se cubría el cartílago.  Como los glicosaminoglicanos son un componente importante del cartílago, y su presencia en el medio, es indicativo de que hubo erosión.  En los experimentos que hicimos, estudiamos el medio despues de la incubación obtuvimos resultados en los que se demostró la erosión, pero lamentablemente encontramos que de igual forma había erosión en los controles negativos (en los cuales solo se incubó el cartilago solo, sin las células degradadoras).  Por este motivo se sugirió como estudio futuro, utilizar otra forma para medir la erosión del cartílago.  Como alternativa una ELISA para colágeno tipo II que mide uno los productos de la degradación de colágeno, podría demostrar una forma alterna de medir cuantitativamente la erosión del cartílago (ya que el colágeno es un componente importante de la estructura del cartílago.